05月28 定位+實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：Plant Journal | BSA助力黃瓜耐水淹定位解析
Bulked Segregant Analysis（BSA）分析是利用極端性狀個(gè)體混池快速進(jìn)行功能基因挖掘的常用方法，廣泛應(yīng)用在植物基因克隆方面。由百邁客和揚(yáng)州大學(xué)陳學(xué)好教授課題組合作，利用SLAF-BSA策略定位黃瓜耐淹基因，相關(guān)研究成果發(fā)表于Plant Journal。
英文標(biāo)題：The major-effect QTL CsARN6.1 encodes an AAA-ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance through promoting adventitious root formation
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http://tour.biocloud.net/article/v1/into/articleDetail/29315927
中文標(biāo)題：CsARN6.1編碼的AAA-ATPase基因通過(guò)促進(jìn)不定根形成增強(qiáng)黃瓜耐水淹性
發(fā)表期刊：the Plant Journal， 2018
影響因子：5.90
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
1.不定根數(shù)目是數(shù)量性狀且與水淹脅迫耐受力顯著相關(guān)
表型觀察發(fā)現(xiàn)，水淹處理7天后，Zaoer-N幼苗下胚軸生長(zhǎng)出許多不定根，而Pepino幾乎沒(méi)有；通過(guò)對(duì)F2群體表型統(tǒng)計(jì)，所有子代的不定根數(shù)目表現(xiàn)出正態(tài)分布，這也說(shuō)明了該性狀為數(shù)量性狀。另外，對(duì)F2群體的949個(gè)個(gè)體進(jìn)行水淹耐受力評(píng)估打分，發(fā)現(xiàn)不定根數(shù)目與水淹耐受力之間呈顯著正相關(guān)，皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.72（P = 0.05），這表明不定根數(shù)目可以作為衡量水淹耐受力的可靠指標(biāo)。
2、ARN6.1的初定位
利用SLAF-seq的方法對(duì)親本及兩個(gè)極端混池進(jìn)行測(cè)序，親本測(cè)序深度分別為29.18×和22.85×，兩個(gè)混池的深度分別為50.6×和53.72×，以9930為參考基因組，利用△SNP-index和ED的方法計(jì)算顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，將關(guān)聯(lián)區(qū)域定位在6號(hào)染色體標(biāo)記SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096之間，區(qū)間大小301kb（圖1）。
3、ARN6.1的精細(xì)定位
利用定位區(qū)間側(cè)翼SLAF標(biāo)記（SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096）上的SNP，分別各開(kāi)發(fā)KASP標(biāo)記（KASP1和KASP13），并對(duì)2274個(gè)F2子代進(jìn)行分析，結(jié)合基因分型和表型數(shù)據(jù)，將ARN6.1定位到61.5kb的區(qū)間（KASP10和KASP11）。為進(jìn)一步縮小區(qū)間，利用KASP10和KASP11對(duì)4417個(gè)F2個(gè)體進(jìn)行分型，得到6個(gè)重組個(gè)體，這6個(gè)重組個(gè)體分別自交得到6個(gè)F2:3家系，然后利用新開(kāi)發(fā)的5個(gè)dCAPS對(duì)F2:3家系進(jìn)行分型，結(jié)合所有表型數(shù)據(jù)，最終將ARN6.1定位在36.1kb的范圍內(nèi)。對(duì)該區(qū)進(jìn)行注釋?zhuān)灿?個(gè)基因，有趣的是，其中5個(gè)基因都被預(yù)測(cè)為編碼AAA 型的ATP酶家族蛋白。
2個(gè)親本重測(cè)序分析，在36.1kb的區(qū)間內(nèi)開(kāi)發(fā)到25個(gè)SNP，研究者對(duì)100個(gè)黃瓜自交系的23個(gè)SNP（2個(gè)SNP只存在于Zaoer-N中而被過(guò)濾掉）進(jìn)行分型，結(jié)合每個(gè)自交系不定根數(shù)目的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行局部關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示SNP02與表型有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。對(duì)SNP02分析發(fā)現(xiàn)，其位于Csa6G504460的第二外顯子，可能就是引起變異的SNP位點(diǎn)。
4、表達(dá)分析驗(yàn)證Csa6G504460
前期研究中，研究者對(duì)親本Zaoer-N和Pepino幼苗下胚軸在水淹處理后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以上定位區(qū)間內(nèi)的7個(gè)基因只有Csa6G504460在處理組和對(duì)照組間存在差異表達(dá)，并且差異表達(dá)只發(fā)生在Zaoer-N中。而后，研究者對(duì)這7個(gè)基因又進(jìn)行qRT-PCR分析，同樣發(fā)現(xiàn)只有Csa6G504460在Zaoer-N的處理組和對(duì)照組間存在差異表達(dá)，并且在處理后36h表達(dá)量差異出現(xiàn)峰值。另外，組織特異表達(dá)分析表明Csa6G504460在多個(gè)組織中均有表達(dá)，但是在根中的表達(dá)量顯著高于其他組織。因此，從基因表達(dá)角度驗(yàn)證了Csa6G504460（以下命名為CsARN6.1）的真實(shí)性。
5、CsARN6.1突變體降低ATP酶活性
基因組和cDNA序列分析顯示，CsARN6.1擁有2個(gè)外顯子，被預(yù)測(cè)為編碼含有511個(gè)氨基酸殘基的AAA-ATPase結(jié)構(gòu)域蛋白，該蛋白中含有一個(gè)coiled-coil結(jié)構(gòu)域（圖2），前期關(guān)聯(lián)到的SNP02即位于該結(jié)構(gòu)域，由于該SNP的突變導(dǎo)致Asp被替換成Gly，Zaoer-N為CsARN6.1^Asp型，表現(xiàn)出較強(qiáng)的ATP酶活性，而Pepino為CsARN6.1^Gly型，幾乎沒(méi)有ATP活性。
6、轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證
為驗(yàn)證CsARN6.1的功能，將CsARN6.1^Asp通過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)克隆后，轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于對(duì)照，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株上可以明顯觀察到側(cè)根發(fā)育，而對(duì)照組則沒(méi)有側(cè)根發(fā)育。為進(jìn)一步驗(yàn)證，研究者將CsARN6.1^Asp轉(zhuǎn)入黃瓜品種Xintaimici（CsARN6.1^Gly型），并經(jīng)多代自交和篩選，獲得單拷貝的純合轉(zhuǎn)基因植株。發(fā)芽后3天，轉(zhuǎn)基因植株的初生根長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于野生型。水淹處理后，轉(zhuǎn)基因黃瓜下胚軸中CsARN6.1的表達(dá)量顯著高于野生型。處理后7天，轉(zhuǎn)基因黃瓜下胚軸的不定根數(shù)目明顯高于野生型。另外，野生型黃瓜葉片和子葉的萎黃病較轉(zhuǎn)基因黃瓜嚴(yán)重。以上轉(zhuǎn)基因結(jié)果證實(shí)CsARN6.1能夠促進(jìn)不定根形成和黃瓜水淹耐受力。
7、ATP酶活性影響黃瓜不定根形成
前期研究發(fā)現(xiàn)，EDTA能夠抑制AAA-ATPase蛋白的ATP酶活性。研究者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EDTA處理的CsARN6.1^Asp蛋白的ATP酶活性相對(duì)于對(duì)照降低24%（圖3 a）。隨后，研究者用加入EDTA的水處Zaoer-N幼苗，以檢測(cè)ATP酶活性損耗對(duì)下胚軸不定根的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EDTA處理后，Zaoer-N沒(méi)有了不定根生成能力（圖3 b.c）。
進(jìn)化樹(shù)分析顯示，CsARN6.1與擬南芥At2G18190和At3G50930存在較高的同源性（圖3d），而在之前研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2處理擬南芥后，At2G18190.1和At3G50930.1被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。水淹后植物體內(nèi)H2O2積累是普遍的生理響應(yīng)。因而研究者嘗試在水中加入H2O2后處理Zaoer-N幼苗，與無(wú)水處理的對(duì)照相比，48h后處理組植株CsARN6.1的表達(dá)量是對(duì)照組的4.3倍，與不加H2O2的水處理的對(duì)照相比，48h后CsARN6.1的表達(dá)量是對(duì)照組的2.1倍（圖3e）。5天后統(tǒng)計(jì)不同處理的材料下胚軸不定根數(shù)目，發(fā)現(xiàn)與不加H2O2的水處理的對(duì)照相比，水中加入H2O2的處理組的不定根數(shù)目增加60%（圖3 f.g）。
總結(jié)
在該研究中，基因挖掘和功能分析使用了SLAF-seq、BSA分析、重測(cè)序、KASP、RNA-seq、qRT-PCR、PCR克隆等測(cè)序和分子實(shí)驗(yàn)方法 成功分離適應(yīng)水淹的主效基因CsARN6.1，并驗(yàn)證基因功能，解析了黃瓜耐水淹分子機(jī)制。
百邁客云BSA分析工具是一款結(jié)合多年BSA分析項(xiàng)目分析經(jīng)驗(yàn)開(kāi)發(fā)的包含一鍵式標(biāo)準(zhǔn)化分析和個(gè)性化多樣性分析集成式分析平臺(tái)．可以進(jìn)行基本分析和個(gè)性化分析，基本分析內(nèi)容包括：1) 原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入；2) 與參考基因組比對(duì)；3) BSA分析；4) 一鍵式生成網(wǎng)頁(yè)版結(jié)題報(bào)告。
工具地址：
https://international.biocloud.net/zh/software/agriculture/detail/6388C5BF964943B7B4B1DDF4811A1BD2
BSA分析，即集群分離分析，它是通過(guò)具有相對(duì)性狀的一對(duì)親本雜交，在其任一分離后代群體中，根據(jù)個(gè)體表型（或基因型）的極端差異，選取一定量個(gè)體，將其DNA，RNA,SLAF-seq(百邁客自主研發(fā)的技術(shù))混合，構(gòu)建兩個(gè)基因池（pool）.然后將混池測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組的序列比對(duì)，基于檢測(cè)到SNP,InDel等變異類(lèi)型，尋找兩混池間存在顯著差異標(biāo)記，利用歐氏距離，SNP-index等算法評(píng)估與性狀關(guān)聯(lián)的區(qū)域．并對(duì)區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行功能注釋和富集分析等等．在基礎(chǔ)上還可以進(jìn)行深入挖掘，如：引物設(shè)計(jì)，區(qū)域內(nèi)基因挖掘及標(biāo)記篩選等等！
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