05月03 高鹽喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠腸道生態(tài)失調(diào)引發(fā)小鼠早期腎損傷
Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers?early renal injury induced by chronic high salt feeding?in mice
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發(fā)表雜志：Experimental & Molecular Medicine
影響因子：5.063
PMID：28857085
前言
高血壓的患病率不斷增加，正在成為世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題，但是高血壓的發(fā)病機制還不完全清楚。 腎損傷和功能障礙可能是導(dǎo)致血壓升高的主要原因之一，一些證據(jù)表明 鹽攝取能夠上調(diào)細胞因子的表達并增加腎臟損傷，但高鹽（HS）攝入與腎損傷發(fā)展之間的關(guān)系尚不清楚。本文研究人員用HS水喂養(yǎng)小鼠持續(xù)8周，并研究由此產(chǎn)生的腸道病理生理變化及其對早期腎臟異常的影響。
材料和方法
使用6至8周齡的雄性特異性無病原體C57BL / 6小鼠。根據(jù)處理方法分為：對照組（飲用水），HS實驗組（飲用水+ NaCl，8周），抗生素實驗組（飲用水+ NaCl+多粘菌素B+新霉素，8周）。
分析內(nèi)容如下：1.微生物分析；2.組織分析；3.基因表達分析，RNA-Seq使用百邁客BioMarker Technologies（Beijing，China）Illumina HiSeq 2500平臺；4.蛋白質(zhì)表達和生化分析；5.FD-4滲透性實驗；6.糞便微生物群移植（FMT）；7.統(tǒng)計分析
分析結(jié)果
1.慢性高鹽攝入導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)
首先，研究人員檢查HS攝入是否會影響腸道細菌。慢性HS喂養(yǎng)后，盲腸中的總細菌負荷略有下降，但無顯著變化（圖1a）。慢性HS喂養(yǎng)后，回腸上皮（圖1b）和結(jié)腸腔內(nèi)（圖1b）的細菌負荷也降低。慢性HS處理顯著降低厚壁菌門和提高擬桿菌的水平，這表明細菌組合物在HS攝入后發(fā)生改變。
圖1. 慢性高鹽喂養(yǎng)減少腸內(nèi)的細菌負荷
為了研究HS攝入如何影響腸道微環(huán)境，研究人員將HS組的細菌組成與對照組相比，在HS處理后，盲腸中Actinobacteria，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes在門水平和Actinobacteria以及Clostridia和Bacteroidia的百分比顯著不同。unweighted uniFrac分析結(jié)果顯示HS和對照組分別聚集（圖2b）。進一步分析顯示，HS和對照組在回腸粘液層分別聚集（圖2c），而對照組和HS組形成兩個聚類，分離趨勢明顯在結(jié)腸粘液層（圖2d）。研究結(jié)果表明，慢性HS喂養(yǎng)可能導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)，細菌計數(shù)和微環(huán)境組成的變化也證明了這一點。
圖2. 慢性高鹽喂養(yǎng)引起腸道生態(tài)失調(diào)
2.慢性高鹽喂養(yǎng)導(dǎo)致消化道反應(yīng)受損的腸道異常
腸道生態(tài)失調(diào)通常與腸道病理生理學的改變有關(guān)，研究人員檢查了慢性HS喂養(yǎng)對腸道變化的影響。在對照組和HS-喂養(yǎng)組小鼠的回腸和結(jié)腸上皮細胞形態(tài)沒有差異（圖3a）。此外，通過TUNEL和ki67染色鑒定的相似數(shù)量凋亡和增殖細胞表明，慢性HS喂養(yǎng)不影響腸道中的細胞死亡（圖3a）。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)炎癥標志物表達被慢性HS攝入顯著改變。特別是，Ccl4，Ccl5和Ifn-γ在HS小鼠的回腸中表現(xiàn)出更高的mRNA水平（圖3b）。 IFN-γ免疫組織化學在回腸中的結(jié)果證實了基因表達數(shù)據(jù)（圖3c）。由于TLR家族蛋白和Nf-κB是參與病原體相關(guān)免疫應(yīng)答的主要分子，進一步評估TLR家族和Nf-κB基因表達，發(fā)現(xiàn)TLR2，TLR3和TLR5mRNA水平在回腸中趨于更高（圖3d）。同時，HS處理后IRF7，GATA3和NFKB2的表達顯著上調(diào)（圖3e）。此外，HS喂養(yǎng)后白細胞中CD38的表達在回腸中升高（圖3f）。然后通過RNA測序進行轉(zhuǎn)錄組分析，并比較涉及“細胞因子 – 細胞因子受體相互作用”，“ NF-κB信號通路“和”Toll樣受體信號通路“。在回腸和結(jié)腸中，兩組之間許多基因的表達是不同的?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明慢性HS攝入導(dǎo)致腸炎癥反應(yīng)中斷。
圖3. 慢性高鹽喂養(yǎng)與腸道炎癥反應(yīng)中斷有關(guān)
3.慢性高鹽攝入導(dǎo)致腸屏障功能喪失并促進細菌易位進入腎臟
腸道免疫反應(yīng)受損始終與腸道屏障功能障礙有關(guān)，研究人員研究了HS的攝入如何影響腸道屏障功能。HS攝入顯著降低了tjp-1，tjp-2，claudin-1，claudin-7和claudin-8基因的表達（圖4a）。 此外，與對照小鼠相比，HS攝入后，回腸和結(jié)腸中屏障形成的緊密連接ZO-1蛋白水平和結(jié)腸中的Occludin蛋白水平顯示出較低的趨勢（圖4c和d）。 另一方面，在HS喂養(yǎng)回腸和結(jié)腸后，成孔緊密連接蛋白Claudin-2蛋白水平顯著較高（圖4c和d）。這些數(shù)據(jù)清楚地表明腸道腸道屏障被慢性HS攝入所破壞。
腸道通透性增加可能導(dǎo)致腸道細菌或細菌產(chǎn)物易位至腸外組織。通過使用16s PCR來識別細菌DNA，檢測到腎臟，肝臟和脾臟中的細菌移位。有趣的是，慢性HS攝入特異性促進了細菌移位進入腎臟，但不能進入肝臟或脾臟（圖4e）。進一步分析了腎細菌，發(fā)現(xiàn)與基于LEfSe測量的對照相比，屬于腸道細菌的桿菌被發(fā)現(xiàn)在HS處理的腎中富集（圖4f）。特別是，與對照動物的腎臟相比，在HS喂養(yǎng)的腎臟中，芽孢桿菌和Planomicrobium的水平分別增加2.6倍和8.7倍。這些結(jié)果表明慢性HS攝入可以促進某些細菌的易位。該數(shù)據(jù)清楚地表明HS喂養(yǎng)與腸道屏障破壞和腸道細菌易位進入腎臟有關(guān)。
圖4. 慢性高鹽喂養(yǎng)導(dǎo)致腸道屏障功能障礙并促進細菌移位進入腎臟
4.慢性高鹽喂養(yǎng)相關(guān)的腸屏障破壞和腎損傷取決于腸道微生物群
為了進一步闡明HS攝入后腸道生態(tài)失調(diào)和腎損傷之間的關(guān)系，給小鼠喂養(yǎng)多粘菌素B和新霉素?？股亟o藥確實恢復(fù)了HS飼喂誘導(dǎo)的回腸Ifn-γ過表達，通過糞便白蛋白和FD-4滲透監(jiān)測腸道泄漏，以及通過血漿內(nèi)毒素水平和腎臟16s / 18s比率監(jiān)測的細菌移位，通過尿和血漿Na +濃度測量，抗生素不改變鈉負荷（圖5a）。雖然8周HS喂養(yǎng)并未引起纖維化等進展性腎損傷，但由col1a1 mRNA水平監(jiān)測（圖5b），HS喂養(yǎng)增加了血漿肌酐水平。更重要的是，與對照組小鼠相比，HS-喂養(yǎng)小鼠腎功能障礙的主要標志物尿白蛋白/肌酐比率顯著增加，抗生素治療幾乎可以完全恢復(fù)腎功能（圖5d）。另外，TUNEL染色顯示抗生素施用可以降低HS誘導(dǎo)的凋亡細胞的升高（圖5e和f）?？傊摂?shù)據(jù)表明，抗生素治療能夠改善腸道滲漏和HS喂養(yǎng)引起的早期腎損傷。
圖5. 抗生素改善慢性高鹽喂養(yǎng)引起的早期腎損傷
5.慢性高鹽喂養(yǎng)引起的收縮壓升高取決于腸道微生物群
慢性HS喂養(yǎng)可能導(dǎo)致動脈壓升高，并且研究人員還檢測到抗生素如何影響這種進展。 如圖6所示，雖然HS處理的小鼠的DBP和平均血壓沒有增加，但是慢性HS喂養(yǎng)后SBP明顯升高。 有趣的是，抗生素治療能夠完全恢復(fù)海拔。 這些數(shù)據(jù)強烈表明慢性HS喂養(yǎng)引起的SBP升高取決于腸道微生物群。
圖6. 抗生素可以恢復(fù)慢性高鹽喂養(yǎng)引起的血壓升高
6.來自慢性高鹽處理的小鼠的腸道微生物群可以獨立地引起腸道泄漏和早期腎損傷
最后，為了進一步證明腸道微生物群是腎損傷發(fā)展的上游因素，進行了糞便微生物群移植實驗。喂食正常飲食（不是高鹽）的兩組小鼠口服來自對照和HS處理的小鼠的糞便。8周后，接受對照糞便的對照小鼠的盲腸壁Firmicutes/Bacteroidetes比例（其是微生物群組成改變的主要標志）顯著高于接受HS糞便的HS小鼠，其為 與研究人員之前的數(shù)據(jù)一致，表明HS喂養(yǎng)降低了盲腸中的Firmicutes / Bacteroidetes比例，并證明該糞便微生物群移植實驗是成功的（圖7a）。此外，如圖7b和c所示，給藥后4周，由糞便白蛋白含量監(jiān)測的腸道通透性在接受HS喂養(yǎng)糞便的小鼠中顯著增加，并且重要的是，尿白蛋白/肌酸酐比率（目前研究中觀察到的腎功能障礙的主要表型）在移植后4周接受HS喂養(yǎng)的糞便的小鼠中也顯著增加。最后，與對照小鼠相比，HS糞便移植小鼠中腎臟凋亡細胞的數(shù)量顯著增加（圖7d和e）。這些數(shù)據(jù)進一步表明，HS喂養(yǎng)引起的腸道生態(tài)失調(diào)是腎損傷和功能障礙的原始誘因。
圖7. 腸道泄漏和腎損傷可通過腸道微生物群轉(zhuǎn)移
創(chuàng)新點
研究人員發(fā)現(xiàn)，暴露于飲食鹽的第一個器官是腸道，基于這一理論研究人員巧妙的研究鹽攝取是否能夠直接破壞腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，反過來引發(fā)早期腎臟損傷。研究結(jié)果顯示，8周的慢性HS喂養(yǎng)導(dǎo)致腎凋亡細胞數(shù)量增加和腎功能損傷增加，這種早期腎損害歸因于腸細菌易位至腎中。由于HS誘導(dǎo)的生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致腸道屏障喪失，發(fā)生易位。該發(fā)現(xiàn)為“腸 – 腎axis”提供了新的見解。目前，沒有證據(jù)表明病原體相關(guān)的分子模式來源于腸可以直接損傷腎臟。因此，該研究是對“腸 – 腎軸”理論的新增加，揭示了HS相關(guān)早期腎損傷發(fā)展的新型基礎(chǔ)發(fā)病機制
參考文獻
Hu J, Luo H, Wang J, et al. Enteric dysbiosis-linked gut barrier disruption triggers early renal injury induced by chronic high salt feeding in mice.[J]. Experimental & Molecular Medicine, 2017, 49(8):e370.