10月31 【成功案例】湖羊骨骼肌發(fā)育過程中全基因組范圍LncRNAs的顯著變化
Genome-Wide Analysis Reveals Extensive Changes?in LncRNAs during Skeletal Muscle Development?in Hu Sheep
湖羊骨骼肌發(fā)育過程中全基因組范圍LncRNAs的顯著變化
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雜志：?genes?
影響因子：3.600
PMID:?28763026
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研究背景：
羊肉具有蛋白含量高、脂肪和膽固醇含量低等優(yōu)點，促進羊的肌肉生長可提高羊肉產(chǎn)量。過去關(guān)于羊骨骼肌生長的研究主要集中在蛋白質(zhì)編碼基因，然而基因組絕大部分是非編碼序列。長非編碼RNA（lncRNAs）是一種重要的非編碼RNA，越來越多研究發(fā)現(xiàn)某些功能型的lncRNAs是新的肌肉調(diào)節(jié)元件，發(fā)揮重要作用。關(guān)于羊肌肉相關(guān)lncRNA的轉(zhuǎn)錄組學研究較少，尤其關(guān)于湖羊的研究更少， lncRNA在羊骨骼肌生長過程中的表達類型和潛在作用大部分都是未知的，因此了解羊不同生長時期肌肉轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化具有重要意義。
本文擬研究湖羊三個關(guān)鍵生長階段（110天胎兒期，5天幼年期，2歲成年期）肌肉lncRNA的表達模式和潛在作用，篩選差異表達lncRNA的和DEGs（差異表達基因）的靶基因。同時通過lncRNA-gene網(wǎng)絡預測湖羊肌肉生長的lncRNA潛在調(diào)控因子，獲得湖羊肌纖維生長相關(guān)的轉(zhuǎn)錄水平的候選調(diào)節(jié)因子。
材料和方法
材料：相同的自然光環(huán)境下飼養(yǎng)的胎兒期、幼年期、成年期湖羊，每個時期選取3個隨機樣本，取既定部位（12和13胸椎之間）的LD肌肉樣本，采樣后即刻液氮冷凍提取RNA。
測序平臺：Illumina platform
分析平臺：百邁客云平臺（BMKCloud），分析內(nèi)容如下：
在百邁客云平臺上，對胎兒期、幼年期、成年期湖羊肌肉細胞進行RNA-seq測序后轉(zhuǎn)錄組拼接。進行注釋后，先排除＜200個核苷酸或單外顯子的轉(zhuǎn)錄子,再用CPC,CNCI,PFAM,CPAT等工具從未知轉(zhuǎn)錄組中篩選候選lncRNA。四種方法FPKM＞0.1的轉(zhuǎn)錄子交集定義為lncRNA轉(zhuǎn)錄子。
應用DEGseq packages (1.10.1)?來分析組間的表達差異，F(xiàn)DR值＜5%，log2(倍數(shù)變化)的絕對值被定義為差異化表達。
預測差異表達的lncRNA的順式靶基因和反式靶基因。
為分析lncRNA的主要功能，通過NCBI的Nr、GO、KEGG、COG數(shù)據(jù)庫比對進行靶基因和DEGs注釋，KS≤0.05，信號通路矯正p值≤0.05的GO term被定義為顯著富集的。
為進一步研究lncRNA和他們的靶基因的相互作用，建立LncRNA-Gene共表達網(wǎng)絡。
結(jié)果：
1.測序拼接和轉(zhuǎn)錄組分析
胎兒期、幼年期、成年期3組RNA-seq序列質(zhì)控后，經(jīng)過去接頭、多聚尾、低質(zhì)量序列后，每組平均獲得了65578070，65591958,71241551的拼接序列，9個文庫平均GC含量為54.39%，每個樣本Q30值≥91.71%，?92%以上與O. aries參考基因組特異性匹配，分析顯示胎兒期有45.1%的序列與外顯子區(qū)域匹配，后期階段匹配度更高（幼年期53.8%、成年期53.7%），在幼年、成年期組的內(nèi)含子和基因間序列比例低于胎兒期。（表1）
表1.矯正后序列與不同階段湖羊參考基因組比對
2.lncRNA篩選和特征性描述
為研究湖羊肌肉lncRNA的基本特征，篩選lncRNA并與mRNA比對。CPC、CNCI、PFKM、CPAT交集部分有6924個lncRNA轉(zhuǎn)錄子，包括已知的保守lncRNA，肌肉分化相關(guān)的lncMD（圖1A）
圖1 A 韋恩圖 ?圖1B. lncRNA和mRNA在每個染色體上的分布比例。紅色和黑色線條分布代表lncRNA和mRNA，藍色線條代表相應染色體在基因組中的大小比例
lncRNA轉(zhuǎn)錄子分為4606個lincRNA（66.5%），1131個內(nèi)含子lncRNA（16.3%）,1187個反義lncRNA（17.1%）。與mRNA類似，lncRNA轉(zhuǎn)錄子在26對染色體和X染色體中分布廣泛，但線粒體中不存在。而且lncRNA在幾個染色體中的比例與染色體大小比例一致，尤其是18號染色體，表明在此研究中相應lncRNA可能體現(xiàn)重要功能（圖1B）
比較lncRNA和mRNA的外顯子特征，結(jié)果顯示大部分lncRNA每個轉(zhuǎn)錄子包含2-5個外顯子（均值3.3），比mRNA少（均值7.9，圖1C）
圖1C 湖羊lncRNA每個轉(zhuǎn)錄子外顯子數(shù) ?????圖1D 湖羊lncRNA外顯子大小分布
另外大部分lncRNA包含2個外顯子，而包含2個外顯子的mRNA僅占比3.9%，明顯低于lncRNA。lncRNA中外顯子平均長度相對長于mRNA，大部分小于200bp（圖1D）。與蛋白編碼基因一致，在肌肉生長過程中同一階段lncRNA表達趨勢相似，且平均表達水平比與蛋白編碼基因低（圖2A,B）
每組重復間的相關(guān)性分析顯示相關(guān)性高（圖3A-C），而且在6924個表達的lncRNA轉(zhuǎn)錄子中，于某一生長階段特異性表達的占比33.03%，這個比例在蛋白編碼基因中較低（4%），提示lncRNA的特殊意義和動態(tài)特性。胎兒期特異性lncRNA為1042個，遠高于幼年期（626）和成年期（619），表明lncRNA在早期發(fā)展階段的重要意義。
圖2A胎兒期、幼年期、成年期湖羊肌肉lncRNA的FPKM分布
圖2B胎兒期、幼年期、成年期湖羊肌肉蛋白編碼基因的FPKM分布
圖3 每組重復間的相關(guān)系數(shù)分析（A胎兒期組，B幼年期組，C成年期組）
3.差異表達分析及靶點基因預測
3個時期兩兩比較分析顯示在胎兒期vs幼年期、幼年期vs成年期、胎兒期vs成年期（對照組vs實驗組），分別有27、14、92個lncRNA，239 270 1437個基因是特異性表達的。(|log2FC| > 1, FDR < 0.05).值得一提的是，幼年期vs成年期組差異表達的lncRNA量最低，在胎兒期vs幼年期組和幼年期vs成年期組，DEGs的數(shù)量幾乎一樣多，表明產(chǎn)前和產(chǎn)后盡管在時間只相差1一個月，但是轉(zhuǎn)錄水平的差異較大（圖4A-D）。
圖4 對比組差異表達lncRNA和基因的數(shù)量（A 不同對比組差異表達lncRNA數(shù)量的韋恩圖 B 不同對比組DEGs數(shù)量的韋恩圖C不同對比組差異表達lncRNA總數(shù) D不同對比組DEGs總數(shù)）
差異表達的lncRNA中，在胎兒期vs幼年期有36個上調(diào)lncRNA，42個下調(diào)lncRNA，幼年期vs成年期有13個上調(diào)lncRNA，28個下調(diào)lncRNA，胎兒期vs成年期有68個上調(diào)lncRNA，78個下調(diào)lncRNA。DEGs中，胎兒期vs幼年期組有1028個上調(diào)基因和487個下調(diào)基因、幼年期vs成年期組有659個上調(diào)基因和900個下調(diào)基因、胎兒期vs成年期有1862個上調(diào)基因和1749個下調(diào)基因。差異表達的lncRNA和DEGs的分層集群顯示幼年期和成年期的表達模式相似而與胎兒期有所差異（圖4E,F）。
圖4 E 差異表達的lncRNA的分層集群 ?F DEGs的分層集群
為進一步評估RNA測序的結(jié)果，選擇MYOG(從胎兒期富集的與晚期肌肉細胞分化相關(guān)的基因)，MYH7(肌肉結(jié)構(gòu)基因)，5種差異表達的lncRNA，4種DEGs進行qRT-PCR分析。表達量與RNA-Seq結(jié)果一致。結(jié)果表明表達與測序結(jié)果有較好相關(guān)性，表明測序結(jié)果可行度高。
lncRNA可以通過與靶基因順式和反式作用發(fā)揮功能，通過兩兩對比分析，預測相鄰上下游100kb的和或差異表達lncRNA的互補蛋白編碼基因。得到共201個靶基因。
圖5 qRT-PCR和RNA-Seq分別驗證不同時期湖羊肌肉差異表達lncRNA和基因的表達水平
4.差異表達的lncRNA和mRNA靶基因的生信分析
為進一步研究差異表達的lncRNA,通過與NR / GO/ COG和KEGG數(shù)據(jù)庫比對，對lncRNA和DEGs的靶基因做注釋。
表2 差異表達lncRNA和DEGs的功能注釋
基于GO數(shù)據(jù)庫，靶基因和DEGs被分別歸到生物學過程，細胞構(gòu)成，分子功能三個功能類別，而且在所有比對中，在肌肉生長過程中發(fā)揮重要作用的器官形成，骨骼肌系統(tǒng)發(fā)展與應激被歸類為顯著富集的GO terms。
圖6不同對比組的差異表達lncRNA和基因的靶基因的top GO分析（A不同對比組的差異表達lncRNA top20個GO terms B不同對比組的DEGs top20個GO terms）
COG功能聚類分析把差異表達的lncRNA和基因分別歸為17和24個類別。在胎兒vs幼年期組，氨基酸轉(zhuǎn)運合成，碳水化合物轉(zhuǎn)運合成，離子轉(zhuǎn)錄合成的靶基因和DEGs的比例比其他兩個對比組高，提示這類基因在產(chǎn)前階段肌肉發(fā)育過程中的重要性。此外，對靶基因和DEGs分析顯示，在幼年期vs成年期組信號轉(zhuǎn)導機制和細胞骨架比其他對比組比例更高，表明這類terms和相應基因在產(chǎn)后肌肉生長中的重要意義（圖7）。
圖7 差異表達lncRNA和DEGs的靶基因的COG分類（A 差異表達lncRNA的靶基因的COG分析 BDEGs的靶基因的COG分析）
根據(jù)KEGG分析，胎兒組vs幼年組，幼年組vs成年組，胎兒組vs成年組的21、6、51個lncRNA的靶基因分別與40、16、48個通路對應。雖然每個對比組的差異表達lncRNA的靶基因數(shù)量少，通路（MAPK信號通路，間隙結(jié)合，鈣信號通路，胰島素信號通路，激動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)）是可被誘導的。這些通路中，MAPK信號通路在胎兒組vs幼兒組，胎兒組vs成年組中最常見，提示此通路和相關(guān)lncRNA可能參與了湖羊肌肉的生長調(diào)控。
在胎兒期vs幼年期，胎兒期vs成年期對比組，氧化磷酸化，碳代謝和心肌收縮是DEGs數(shù)量最高的前三個通路，在幼年期vs成年期組卻不是。值得注意的是，途徑如糖酵解和生成，脂肪酸降解，氨基酸合成的和過氧物酶體增殖激活受體?(PPAR)信號通路特異性存在于胎兒期vs幼年期組，提示這些途徑中DEGs在早期肌纖維生長過程中的重要作用。此外磷酸肌醇激酶-3-激酶蛋白激酶B(PI3k-Akt)信號通路和類固醇合成在幼年期vs成年期組中特異性存在，強化了它們在產(chǎn)后肌肉生長中的作用。總之，差異表達的lncRNA和DEGs在肌肉生長調(diào)節(jié)方面顯示了巨大潛力。
表3 不同對比組的DEGs的KEGG通路
5.肌纖維增長相關(guān)的潛在功能性lncRNA篩選
為研究lncRNA如何與靶基因來調(diào)節(jié)肌肉生長，依據(jù)FPKM進行差異表達lncRNA和對應的差異表達靶基因的共表達分析,共獲得了15（胎兒組vs幼年組），7（幼年期vs成年期），37（胎兒期vs成年期）個共調(diào)節(jié)的lncRNA-基因?qū)?。三個網(wǎng)絡都顯示了與肌肉生長相關(guān)的候選lncRNA（圖8）。差異表達的lncRNA和相應的差異表達的順式和反式作用的靶基因來構(gòu)建lncRNA-基因互作網(wǎng)絡。差異表達的靶基因直接與肌肉生長過程相關(guān)，對靶基因?qū)牟町惐磉_lncRNA也進行了分類。
圖8 不同對比組lncRNA-基因關(guān)系網(wǎng)絡
（A胎兒期/幼年期組，B幼年期/成年期組，C胎兒期/成年期組；基因以紫色表示，lncRNA以綠色表示，上調(diào)用三角形表示，下調(diào)用圓形表示，順式作用實心線表示，反式用虛線表示）
隨后通過GO分析得到了8個生物學過程和相關(guān)20個mRNA和41個lncRNA，如RTL1和JPH2(表S5)。
qRT-PCR分析顯示在肌肉生長過程中l(wèi)ncRNA表達和對應靶基因變化一致，包括TCONS_00606329和它的靶基因elastin，TCONS_00758916、?TCONS_00685981 和他們的靶基因phosphofructokinase?muscle and ankyrin repeat?SOCS box containing 8; TCONS_00297401和靶基因泛素特異性蛋白酶2編碼基因，
TCONS_00377352, TCONS_00381991、TCONS_00381994和他們的靶基因RTL1 (圖?9)?。這些結(jié)果進一步揭示了lncRNA和他們靶基因的互作關(guān)系。
圖9胎兒期、幼年期、成年期差異表達lncRNA和共表達的靶基因的表達水平的qRT-PCR驗證
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研究結(jié)論
本研究基于Illumina平臺，篩選出一系列與湖羊三個關(guān)鍵生長時期相關(guān)的lncRNA和基因，篩選得到的6924個差異表達的lncRNA轉(zhuǎn)錄子中，特異性表達于某一生長階段的占比高于蛋白編碼基因（33.03%：4%），提示lncRNA的特殊意義和動態(tài)特性。且在胎兒期階段特異性lncRNA數(shù)量較多，提示lncRNA在早期發(fā)展階段的重要意義。
通過兩兩比較分析篩選特異性表達的lncRNA和基因，在胎兒期vs幼年期、幼年期vs成年期、胎兒期vs成年期（對照組vs實驗組）分別得到特異性表達的27、14、92個lncRNA，239 270 1437個基因。差異表達的lncRNA和DEGs的分層集群顯示幼年期和成年期的表達模式相似，與胎兒期有差異。
選擇MYOG，MYH7，5種差異表達的lncRNA，4種DEGs進行qRT-PCR分析。表達量與RNA-Seq結(jié)果一致，測序結(jié)果可信度高。
通過與NR，GO,COG,KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，對差異表達lncRNA和基因的靶基因進行了多種肌肉相關(guān)生物學過程的注釋。且構(gòu)建了lncRNA-gene 共調(diào)控網(wǎng)絡，提供了候選lncRNA的有價值的信息，?qRT-PCR分析顯示在肌肉生長過程中l(wèi)ncRNA表達和對應靶基因變化一致。
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創(chuàng)新點
首次對三個關(guān)鍵生長階段的湖羊肌肉生長相關(guān)lncRNA進行系統(tǒng)性描述。從轉(zhuǎn)錄子結(jié)構(gòu)和表達模式上研究lncRNA，然后進一步預測lncRNA的靶基因來進行功能研究。為進一步研究湖羊lncRNA功能提供了依據(jù)，為促進湖羊肌肉生長提供了有價值的信息。