09月01 【成功案例】小RNA和降解組聯(lián)合測(cè)序揭示microRNA調(diào)節(jié)茶葉(Camellia sinensis)中兒茶素生物合成
小RNA和降解組聯(lián)合測(cè)序揭示microRNA調(diào)節(jié)茶葉(Camellia sinensis)中兒茶素生物合成
Combined small RNA and degradome?sequencing reveals complex microRNA?regulation of catechin biosynthesis in tea?(Camellia sinensis)
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雜志：PLOS ONE
影響因子：2.806
PMID:?28225779
研究背景
MicroRNAs是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，在動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及其他生物學(xué)過程中有至關(guān)重要的作用。基于堿基互補(bǔ)配對(duì)機(jī)制，miRNAs主要通過直接切割目標(biāo)mRNA和抑制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄這兩種方式調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)。前期研究表明，miRNA參與多種植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過程，如：根、葉、花的形態(tài)發(fā)生，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激素反應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)代謝等。植物miRNAs主要通過克隆、生物信息預(yù)測(cè)、高通量測(cè)序和Northern 雜交的方法來檢測(cè)。最常用的技術(shù)是高通量測(cè)序，不僅經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，而且在低豐度的情況下可以更簡(jiǎn)單、快速獲得大量miRNAs。植物中miRNA主要是通過切割目標(biāo)基因或者抑制目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，所以目標(biāo)基因的確定對(duì)miRNA功能的分析至關(guān)重要。miRNAs目標(biāo)基因的預(yù)測(cè)可以通過生物信息的方法，目標(biāo)基因的鑒定主要通過降解組測(cè)序和5’-RLM-RACE方法（RNA連接酶介導(dǎo)的5’cDNA末端的快速擴(kuò)增），這兩種方式還能鑒定miRNA目標(biāo)基因切割位點(diǎn)，有助于miRNA功能分析。
茶樹（Camellia sinensis），富含兒茶素，是風(fēng)靡全球的非酒精飲料之一。兒茶素是茶葉中重要的組成部分，包括脂型兒茶素（如：ECG和EGCG）和非脂型兒茶素（如：EC和EGC）。EGCG是茶葉中含量最豐富的兒茶素并且具有較強(qiáng)的抗癌效果，可以制約癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制雄激素受體的功能并調(diào)控癌細(xì)胞的生存，血管的生成和移動(dòng)?；谒麄兊姆肿訕?gòu)成，兒茶素可以分為簡(jiǎn)單兒茶素和脂型兒茶素。在兒茶素的合成過程中有許多酶的參與，如查耳酮合酶（CHS），查爾酮異構(gòu)酶（CHI），黃烷酮醇4-還原酶（DFR），花青素合酶（ANS），花青素還原酶（ANR）和類黃酮3,5羥基化酶（F3’5’H）。MiRNA被鑒定為轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，并且裂解目標(biāo)mRNA是植物中基因表達(dá)的主要調(diào)控方式。
在茶樹中，雖然通過高通量測(cè)序和芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多保守的以及新的miRNAs，但是miRNAs直接調(diào)控兒茶素生物合成還沒有明確的定義。此項(xiàng)研究中，研究人員通過高通量測(cè)序鑒定茶葉中保守的以及新的miRNAs，再通過5’-RLM-RACE方法分析潛在的目標(biāo)miRNAs。通過表達(dá)模式分析進(jìn)一步篩選兒茶素積累過程中潛在的miRNAs。結(jié)合5’-RLM-RACE實(shí)驗(yàn)和表達(dá)模式分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些新的調(diào)節(jié)兒茶素生物合成途徑中基因切割的調(diào)控因子。
材料和方法
實(shí)驗(yàn)材料
茶樹1005，取葉片（包括芽，第一葉，第二葉，第三葉，第四葉，第五葉，成熟葉），進(jìn)行混合，提取總RNA。
茶樹1005，取葉片（包括第一葉，第三葉，成熟葉），進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析和兒茶素含量測(cè)定。
測(cè)序平臺(tái)：Illumina?HiSeq 2500?（Biomarker Technology Co.）
技術(shù)路線
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.茶葉中miRNA的初步分析
從提取的總RNA中構(gòu)建smallRNA文庫(kù)，測(cè)序質(zhì)控后得到19，567，691條clean reads，與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)有18.83%的rRNA，1.23%的tRNA，0.01%的small nuclear RNA，0.07%的重復(fù)序列，其中79.85%的序列沒有功能注釋，可以將這些沒有功能注釋的序列用來做下一步的miRNA的預(yù)測(cè)和鑒定。根據(jù)smallRNA的測(cè)序長(zhǎng)度分布圖可以得出，miRNA的長(zhǎng)的主要分布在20-25nt之間，豐度最高的是24nt（47.89%）。這個(gè)長(zhǎng)度分布和其他栽培茶以及其他植物報(bào)道的結(jié)果非常相似。
2.茶葉中保守miRNAs的鑒定
將沒有功能注釋的clean reads與miRBase（植物已知保守miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行比對(duì)，共獲得69個(gè)保守的miRNAs，分別屬于62個(gè)家族。根據(jù)長(zhǎng)度分布發(fā)現(xiàn)，這些保守的miRNAs的長(zhǎng)度主要集中在18-25nt之間，長(zhǎng)度主要集中在24nt（46.385），其次是21nt。
對(duì)高通量測(cè)序的miRNA片段進(jìn)行分析，鑒定的保守miRNA中，read values低于1000的占91.3%的比例，其中read values低于10的占56.52%的比例。研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些高表達(dá)(read values大于1000)的miRNA家族，如miR165a和miR396a。另外，在不同家族中的miRNAs表達(dá)量差異較大，并且在同一家族中各miRNAs之間的表達(dá)量也有較大差異。這些數(shù)據(jù)表明，不同家族miRNA的表達(dá)模式不同，意味著不同的miRNAs在茶樹生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用不一樣。
3.茶葉中新miRNAs的鑒定
通過miRDeep2和Mfold軟件分析，共鑒定出47個(gè)新的miRNAs，進(jìn)一步對(duì)這些新miRNA進(jìn)行片段長(zhǎng)度和表達(dá)量分析。新miRNA跟保守miRNA長(zhǎng)度分布相似，主要集中在18-25nt之間，最集中的長(zhǎng)度是24nt和21nt。另外，新miRNA的表達(dá)量比保守miRNA的低，新miRNA中表達(dá)量最高的只有4517個(gè)read values。
研究人員將這些新的miRNA與其他植物中已知的miRNA進(jìn)行比對(duì)，揭示了許多同系物。除了三個(gè)miRNA歸為同一個(gè)家族外，絕大多數(shù)的miRNA可以被分為獨(dú)立的家族。研究者還對(duì)新miRNA的前體進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)他們都有一個(gè)發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度在84-114bp。
4.GO功能富集和KEGG通路分析目標(biāo)miRNA
為了研究茶樹miRNA的功能，研究人員運(yùn)用TargetFinder軟件和轉(zhuǎn)錄序列對(duì)上述miRNA進(jìn)行目標(biāo)基因預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，其中97個(gè)miRNA對(duì)644個(gè)目標(biāo)基因有調(diào)控作用。再將644個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析：GO富集分析發(fā)現(xiàn)這些目標(biāo)基因主要富集在細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、連接活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、新陳代謝和細(xì)胞進(jìn)程等功能條目；KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)366個(gè)目標(biāo)基因參與36個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，主要參與糖酵解、檸檬酸循環(huán)、氨基酸代謝、光合作用、脂肪酸代謝、嘌呤嘧啶代謝、氧化磷酸化、植物病原體相互作用、初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物過程。
- miRNA靶向基因降解組測(cè)序和功能分析
為了進(jìn)一步預(yù)測(cè)和鑒定miRNA靶向基因，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了降解組文庫(kù)并進(jìn)行深度測(cè)序，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和上述獲得的miRNAs，通過TargetFinder軟件預(yù)測(cè)到216個(gè)靶向基因被97個(gè)miRNAs調(diào)控。在這些靶向基因中，降解組測(cè)序鑒定了26個(gè)基因的26個(gè)切割位點(diǎn)，被16個(gè)miRNA家族的19個(gè)miRNAs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，如表1。
表1.通過降解組測(cè)序鑒定茶樹1005中miRNA靶向基因
- 基于5’-RLM-RACE技術(shù)對(duì)目標(biāo)斷裂位點(diǎn)的驗(yàn)證
研究人員采用5’-RLM-RACE的方法，對(duì)其中5個(gè)有注釋的miRNA（來自降解組測(cè)序）切割位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，目標(biāo)基因comp152929被csn-miR396a1 和?csn-miR396a2共同調(diào)控，切割位點(diǎn)在目標(biāo)基因的第11-12個(gè)核苷酸處；兩個(gè)基因comp159882和comp157894同時(shí)被miRNA167a調(diào)控，且有共同的切割位點(diǎn)，在目標(biāo)基因的第11-12個(gè)核苷酸處；另外，miRNA394a調(diào)控comp156493，切割位點(diǎn)有兩處，分別為第10-11，17-18個(gè)核苷酸處；同樣的，novel-miR2調(diào)控comp145093，切割位點(diǎn)也有兩處，分別為第10-11，12-13個(gè)核苷酸處。5’-RLM-RACE的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些降解組分析的結(jié)果，另外一些切割位點(diǎn)有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。
7.茶葉中miRNA的表達(dá)模式分析
對(duì)茶樹1005葉片兒茶素含量的研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素在不同葉片中的的含量由高到低排序?yàn)椋旱谝蝗~，芽，第二葉，第三葉，成熟葉。第一葉，第三葉和成熟葉的兒茶素含量有顯著差異。
為了探索茶葉中miRNAs與兒茶素合成相關(guān)性，研究人員采用qRT-PCR的方法分析第一葉、第三葉以及成熟葉中miRNA（read values高于平均值）表達(dá)。通過表達(dá)模式的成簇分析將這些miRNA分成三組。第一組，miRNA表達(dá)模式與兒茶素含量成正相關(guān)，分別有novel-miR10, novel-miR13, novel-miR19, csn-miR165a, csn-miR170, csn-miR2593e 和novel-miR12；第二組，miRNA表達(dá)模式與兒茶素含量成負(fù)相關(guān)，分別有novel-miR1, novel-miR2, csn-miR160a, csn-miR162a, csn-miR394 和csn-miR396a；第三組，miRNA表達(dá)模式與兒茶素含量沒有顯著相關(guān)性，有csn-miR4380a。
8.調(diào)控兒茶素生物合成基因miRNA的鑒定
為了深入了解miRNA在調(diào)控兒茶素合成代謝中的功能，研究人員將高通量測(cè)序獲得的miRNA跟NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)以及RNA測(cè)序的兒茶素生物合成相關(guān)基因的mRNA進(jìn)行BLAST，預(yù)測(cè)可能的miRNA。為了消除假陽(yáng)性，對(duì)預(yù)測(cè)的斷裂位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過5’-RLM-RACE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了6個(gè)可能參與兒茶素生物合成功能基因表達(dá)調(diào)控的miRNA。它們分別是csn-miRNA167a、f csn-miR2593e、csn-miR4380a 、csn-miR3444b 、csn-miR5251 和csn-miR7777-5p.1。
9.兒茶素生物合成路徑基因和miRNAs表達(dá)分析
為了更好的了解兒茶素生物合成過程中miRNA與目標(biāo)基因之間的表達(dá)模式以及相互作用，研究人員將不同葉片中兒茶素生物合成相關(guān)基因和miRNA表達(dá)量進(jìn)行分析，并且與兒茶素含量變化的模式相比較。結(jié)果顯示，ANR和C4H有相似的表達(dá)模式，ANR在第三葉中表達(dá)量最高，它與EC，EGC和兒茶素含量沒有明顯的關(guān)系，在綠茶Shuchazao中有過類似的報(bào)道。CHI和DFR的表達(dá)量與兒茶素的含量成正相關(guān)的趨勢(shì)，這與之前的報(bào)道一致。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的miRNA表達(dá)模式與目標(biāo)基因呈相反的趨勢(shì)。總之，miRNA和目標(biāo)mRNA之間的表達(dá)模式和斷裂位點(diǎn)的負(fù)相關(guān)性是兒茶素生物合成中目標(biāo)miRNA靶向調(diào)控mRNA的有力證據(jù)。
結(jié)論
該研究共鑒定了69個(gè)保守的miRNAs和47個(gè)新的miRNA。再結(jié)合降解組測(cè)序的和生物信息分析的方法預(yù)測(cè)了受19個(gè)miRNA調(diào)控的16個(gè)基因切割位點(diǎn)。通過5’-RLM-RACE實(shí)驗(yàn)對(duì)其中5個(gè)有注釋的miRNA切割位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。qRT-PCR結(jié)果顯示：novel-miR1, novel-miR2,csn-miR160a, csn-miR162a, csn-miR394 和 csn-miR396a與兒茶素含量負(fù)相關(guān)。6個(gè)miRNA（csn-miRNA167a，csn-miR2593e，csn-miR4380a，csn-miR3444b，csn-miR5251和csn-miR7777-5p.1）及其與兒茶素生物合成相關(guān)的靶基因的表達(dá)也通過qRT-PCR進(jìn)行了分析；這些miRNA和兒茶素含量之間呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，而在其目標(biāo)基因和兒茶素含量之間呈正相關(guān)。這個(gè)結(jié)果表明這些miRNA可能通過下調(diào)它們來負(fù)調(diào)節(jié)兒茶素生物合成生物合成相關(guān)靶基因。綜上所述，miRNA是茶葉中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，5′-RLM-RACE和表達(dá)分析的結(jié)果揭示了miRNAs在兒茶素合成代謝中的重要作用。
創(chuàng)新點(diǎn)
本研究采用多種生物技術(shù)手段的聯(lián)合分析（高通量測(cè)序，降解組測(cè)序，qRT-PCR技術(shù)和5’-RLM-RACE技術(shù)），尋找到新的調(diào)節(jié)兒茶素生物合成的miRNA，并且驗(yàn)證了miRNA調(diào)控的切割位點(diǎn)。